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干貨分享 | 細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取

瀏覽數(shù)量： 0 作者：本站編輯發(fā)布時(shí)間： 2024-07-15 來源：本站

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提取蛋白質(zhì)是做好WB實(shí)驗(yàn)的第一步，為保證蛋白質(zhì)的質(zhì)量和穩(wěn)定性，提取過程中需全程保持低溫，并提前預(yù)冷離心機(jī)及裝蛋白質(zhì)的離心管。

1、細(xì)胞鋪板

使用6cm小皿進(jìn)行細(xì)胞鋪板，蓋和底部都需做好標(biāo)記，用“∞”法將細(xì)胞搖勻。待細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)收樣。

建議使用愛津6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，經(jīng)TC處理后，細(xì)胞貼壁效果良好。

2、收樣

微信圖片_20240704102847

長(zhǎng)成這樣就差不多了

棄去舊的培養(yǎng)基，使用PBS洗滌兩次（此時(shí)細(xì)胞仍為活細(xì)胞，無(wú)預(yù)冷PBS），用槍頭吸干殘余液體，將培養(yǎng)皿置于冰上預(yù)冷。若細(xì)胞生長(zhǎng)速度不同，可以先將樣品放在-80℃，待所有樣品收集完畢后再進(jìn)行提取。

3、裂解

冰上裂解15min

向6cm小皿中加入120μL裂解液（可直接使用無(wú)添加PMSF的裂解液，若使用RIPA裂解液則需按100：1加入PMSF，現(xiàn)配現(xiàn)用）。輕輕晃動(dòng)小皿使裂解液均勻分布，冰上裂解15分鐘。在裂解期間，標(biāo)記好1.5mL離心管并插置于冰上預(yù)冷，同時(shí)將離心機(jī)預(yù)冷至4℃。準(zhǔn)備好細(xì)胞刮（建議選擇刮頭較寬的細(xì)胞刮刀，刮取效率更高）。

標(biāo)記好1.5ml離心管并置于冰上預(yù)冷

4、刮蛋白

使用細(xì)胞刮將蛋白刮下，刮到邊緣，用槍吸取轉(zhuǎn)移至預(yù)冷好的1.5mL離心管中。刮蛋白時(shí)在培養(yǎng)皿下墊一塊冰磚以保持低溫。

5、超聲

一般進(jìn)行3-5次超聲，超聲過程中會(huì)產(chǎn)生熱量，因此超聲完畢后需立即將離心管插入冰上或放入冰盒中降溫。如果沒有超聲機(jī)，可以使用渦旋混勻儀混勻60秒。

6、離心去上清

4℃，12000g離心6分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷好的全新離心管中。

7、蛋白定量與上樣

使用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算上樣體積，一般上樣量為30μg。

8、煮樣

按4:1比例加入5×Loading Buffer，渦旋充分混勻。金屬浴100℃煮5分鐘，煮完后立即置于冰上冷卻。

9、保存

如果不立即使用，樣品應(yīng)及時(shí)保存在-20℃環(huán)境下。

蛋白質(zhì)提取是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，嚴(yán)格保持低溫、選擇合適的實(shí)驗(yàn)器材、規(guī)范操作，每一步都非常重要。建議使用愛津6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，產(chǎn)品經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)量控制，能有效提高蛋白質(zhì)的質(zhì)量和穩(wěn)定性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠基礎(chǔ)。選擇合規(guī)產(chǎn)品，讓實(shí)驗(yàn)更高效、更順利！

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